Autofluoreszenz von Chlorophyll bei Anregung mit 470 nm – sichtbar gemacht im Fluoreszenzmikroskop

Chlorophyll besitzt eine ausgeprägte Eigenfluoreszenz (Autofluoreszenz), die sich ohne zusätzliche Farbstoffe direkt im Fluoreszenzmikroskop beobachten lässt. Dieses Phänomen eignet sich hervorragend, um chloroplastenhaltige Gewebe schnell und selektiv darzustellen.

Physikalischer Hintergrund

Chlorophyll absorbiert Licht vor allem in zwei Spektralbereichen:

• Blau: ca. 430–480 nm

• Rot: ca. 640–680 nm

Wird ein Pflanzenpräparat mit 470 nm (blaues Licht) angeregt, absorbieren die Chlorophyllmoleküle diese Energie. Ein Teil der Energie wird für photochemische Prozesse genutzt, der Rest wird als Fluoreszenz wieder abgegeben.

Die Emission erfolgt im:

• tiefroten Bereich (~660–680 nm)

• teilweise bis in den nahen Infrarotbereich (~700 nm)

Der Prozess folgt dem Stokes-Shift: Emittiertes Licht hat eine längere Wellenlänge (geringere Energie) als das Anregungslicht.

Darstellung im Fluoreszenzmikroskop

Für die Beobachtung wird typischerweise ein Filterset verwendet:

• Anregungsfilter: ~450–490 nm (Blau)

• Dichroitischer Spiegel: ~500 nm

• Emissionsfilter: >600 nm (Langpass oder Rotfilter)

Im Bild erscheinen:

• Chloroplasten: leuchtend rot

• Zellwände, Cytoplasma: dunkel oder schwach autofluoreszent

• Nicht-grüne Gewebe: kaum Signal

Dadurch entsteht ein hoher Kontrast ohne zusätzliche Färbung.

Biologische Bedeutung der Autofluoreszenz

Die Chlorophyllfluoreszenz entsteht, wenn angeregte Elektronen nicht vollständig in der Photosynthese genutzt werden. Die Intensität der Fluoreszenz hängt daher ab von:

• physiologischem Zustand der Pflanze

• Lichtstress oder Schädigung

• Wasserstatus

• Photosyntheseaktivität

In der Forschung wird dieses Prinzip für Chlorophyll-Fluoreszenzanalysen (z. B. Fv/Fm) zur Bewertung der Photosyntheseeffizienz genutzt.

Praktische Hinweise für die Mikroskopie

• Frische Präparate zeigen die stärkste Fluoreszenz.

• Zu starke Beleuchtung vermeiden → Photobleaching.

• Dünne Schnitte oder Blattabzüge liefern die besten Ergebnisse.

• Auch fixiertes Material fluoresziert, allerdings oft mit reduzierter Intensität.

Typische Anwendungen

• Lokalisierung von Chloroplasten in Geweben

• Unterscheidung grüner vs. nicht-grüner Zelltypen

• Untersuchung von Blattstrukturen und Algen

• Schnelltest der Gewebevitalität